การวินิจฉัยโรคมือ เท้า ปาก มักทำในทางคลินิก สามารถตรวจพบไวรัสในอุจจาระได้ประมาณหกสัปดาห์หลังการติดเชื้อ อย่างไรก็ตาม การหลุดออกจากคอหอยโดยทั่วไปจะน้อยกว่าสี่สัปดาห์ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงของการตัดชิ้นเนื้อหรือการขูดถุงน้ำจะแยกแยะ โรคมือเท้าปาก จากไวรัส varicella-zoster และไวรัสเริม แม้ว่าเซรุ่มวิทยาจะไม่ไวต่อการวินิจฉัยโรคมือเท้าปาก แต่ระดับ IgG ก็สามารถใช้เพื่อติดตามการฟื้นตัวได้ ในศูนย์บางแห่ง มีการใช้ซีรั่มวิทยาเพื่อแยกแยะเอนเทอโรไวรัส 71 จากค็อกซากีไวรัส เนื่องจากมีความสำคัญในการพยากรณ์โรค ปัจจุบัน การตรวจวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสมีให้บริการในศูนย์ส่วนใหญ่เพื่อยืนยันการวินิจฉัยโรคคอกซากีไวรัส ไม้กวาดของรอยโรคสามารถตรวจพบ coxsackievirus หรือ enterovirus ได้โดยใช้การตรวจ PCR แบบเรียลไทม์